近期，翌圣鎂孚泰基于天木生物高通量皮升級(jí)液滴單細(xì)胞分選系統(tǒng)（DREM cell）設(shè)備，在《The FEBS Journal》期刊上發(fā)表題為Engineered T7 RNA polymerase reduces dsRNA formation by lowering terminal transferase and RNA-dependent RNA polymerase activities的研究論文。該研究使用DREM cell高通量細(xì)胞分選儀，結(jié)合酶的定向進(jìn)化技術(shù)，對(duì)T7 RNAP進(jìn)行了成功改造，改造后的T7 RNAP在轉(zhuǎn)錄過程中能夠直接大幅減少dsRNA的生成（僅為野生型的1.8%），同時(shí)顯著提升了合成mRNA的整體效率和質(zhì)量。這一突破性進(jìn)展有望為基因治療和疫苗開發(fā)領(lǐng)域帶來革命性的變化，推動(dòng)相關(guān)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。
研究背景
雙鏈RNA（dsRNA）是體外轉(zhuǎn)錄（IVT）過程中常見的副產(chǎn)物，可激活宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)（如通過PKR和OAS通路抑制翻譯），影響mRNA藥物的安全性和有效性。T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）是IVT的核心工具，但其末端轉(zhuǎn)移酶活性和RNA依賴性RNA聚合酶（RDRP）活性會(huì)導(dǎo)致dsRNA生成。傳統(tǒng)方法依賴純化去除dsRNA，但本研究提出通過改造T7 RNAP本身減少dsRNA的產(chǎn)生，以提高mRNA產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性。
方法與技術(shù)平臺(tái)
1、高通量篩選技術(shù)（FADS）
原理：基于DREM cell設(shè)備液滴微流控方法生成液滴，液滴內(nèi)包含裂解試劑、熒光底物和過表達(dá)目標(biāo)酶突變體的大腸桿菌細(xì)胞，孵育過程進(jìn)行細(xì)胞的裂解和RNA轉(zhuǎn)錄，隨后將液滴導(dǎo)入分選芯片進(jìn)行熒光檢測(cè)和分選。
優(yōu)勢(shì)：超高通量（每日篩選106-108液滴）、低試劑消耗（皮升級(jí)反應(yīng)體積）。
流程：構(gòu)建隨機(jī)突變庫→液滴內(nèi)轉(zhuǎn)錄→熒光檢測(cè)→分選高熒光液滴（對(duì)應(yīng)低dsRNA突變體）
（液滴生成與分選）
2、分子信標(biāo)與雙探針檢測(cè)
分子信標(biāo)：結(jié)合RNA 3'端，熒光強(qiáng)度與互補(bǔ)區(qū)長(zhǎng)度正相關(guān)，用于區(qū)分完整RNA和dsRNA。
雙探針系統(tǒng)：5'端Cy5探針檢測(cè)RNA產(chǎn)量，3'端FAM探針檢測(cè)dsRNA含量，通過熒光比值篩選高產(chǎn)低副產(chǎn)物突變體。
3、半理性設(shè)計(jì)與結(jié)構(gòu)分析
靶點(diǎn)選擇：結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬（GROMACS）和FoldX/PROSS軟件，針對(duì)T7 RNAP構(gòu)象轉(zhuǎn)換關(guān)鍵區(qū)域（如螺旋C、H亞結(jié)構(gòu)域）進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變。
關(guān)鍵突變位點(diǎn)：A70Q（穩(wěn)定延伸構(gòu)象）、F162S/A247T（降低RDRP活性）、K180E（減少模板結(jié)合偏向性）。
4、功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
dsRNA檢測(cè)：J2抗體免疫印跡、ELISA定量。
免疫原性評(píng)估：轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞檢測(cè)IFN-β表達(dá)，HEK293細(xì)胞評(píng)估EGFP翻譯效率。
酶活性分析：通過發(fā)夾結(jié)構(gòu)底物檢測(cè)RDRP活性，NGS分析RNA 3'端異質(zhì)性評(píng)估末端轉(zhuǎn)移酶活性。
1. 突變體篩選與性能
使用DREM cell生成兩個(gè)百萬級(jí)液滴文庫（Lib3，Lib5），經(jīng)過兩輪分選成功篩選出關(guān)鍵候選突變體
單點(diǎn)突變體：M1（V214A）、M7（F162S/A247T）、M11（K180E）、M14（A70Q）顯著降低dsRNA生成（達(dá)野生型的3-7%）。
組合突變體：M17（A70Q/F162S/K180E），表現(xiàn)最優(yōu)，dsRNA含量?jī)H為野生型的1.8%，在篩選體系中僅為0.007 ng/μg。
這一結(jié)果不僅在體外實(shí)驗(yàn)中得到了驗(yàn)證，還在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出顯著的免疫原性降低和蛋白翻譯效率提升。我們將突變體轉(zhuǎn)錄的mRNA導(dǎo)入RAW264.7細(xì)胞后，最優(yōu)突變體M11產(chǎn)物引發(fā)的干擾素β（IFN-β）的mRNA和蛋白表達(dá)量?jī)H為野生型的9.7%和12.93 pg/mL。在HEK293細(xì)胞中，突變體mRNA的EGFP表達(dá)細(xì)胞數(shù)顯著增加，且熒光強(qiáng)度穩(wěn)定。這表明，減少dsRNA可有效解除PKR介導(dǎo)的翻譯抑制，釋放mRNA治療潛力。
2. 機(jī)制解析
末端轉(zhuǎn)移酶活性：野生型T7 RNAP傾向于在RNA 3'端添加額外核苷酸（如胞嘧啶），促進(jìn)互補(bǔ)配對(duì)；突變體（如M17）該活性降低50%以上。
RDRP活性：突變體對(duì)RNA模板的結(jié)合能力減弱，減少了以RNA為模板的互補(bǔ)鏈合成。
構(gòu)象穩(wěn)定性：突變（如A70Q）通過穩(wěn)定延伸構(gòu)象，減少流產(chǎn)RNA生成，從而間接抑制dsRNA形成。
為了深入了解突變體降低dsRNA的作用機(jī)制，我們通過計(jì)算機(jī)模擬與功能實(shí)驗(yàn)，揭示了突變體是由于降低了RNA依賴的RNA聚合酶（RDRP）活性和末端轉(zhuǎn)移酶活性而導(dǎo)致dsRNA的降低，這一發(fā)現(xiàn)為未來進(jìn)一步優(yōu)化 T7 RNAP提供了重要的理論依據(jù)。
3. 應(yīng)用潛力
突變體mRNA的免疫原性顯著降低（IFN-β表達(dá)下降90%），且翻譯效率提高（EGFP陽性細(xì)胞數(shù)增加）。
為mRNA疫苗/藥物的生產(chǎn)提供了更安全、高效的T7 RNAP工具。
1. 隨機(jī)突變庫+DREM cell：構(gòu)建基于分子信標(biāo)熒光探針的高通量分選系統(tǒng)，采用DREM cell累計(jì)篩選超過107個(gè)液滴，篩選效率大幅提升。
2. 微液滴反應(yīng)體系：液滴內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞裂解、轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及熒光探針結(jié)合過程，精準(zhǔn)捕捉低產(chǎn)dsRNA突變體，試劑消耗降低百倍。
3. 酶工程突破：T7 RNAP組合突變M17（A70Q/F162S/K180E），dsRNA含量降至野生型的1.8%。
4. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：M17突變體顯著降低免疫因子IFN-β表達(dá)，提升EGFP蛋白翻譯效率。
5. 機(jī)制揭秘：末端轉(zhuǎn)移酶活性是“元兇”，突變體通過降低末端轉(zhuǎn)移酶和RNA依賴的RNA聚合酶（RDRP）活性，減少3'端非模板核苷酸添加，阻斷dsRNA互補(bǔ)配對(duì)。
關(guān)于DREM cell 高通量液滴微流控細(xì)胞分選儀
DREM cell 是一款集合液滴生成、液滴分選、液滴微注入及液滴打印的多功能、高通量、全自動(dòng)設(shè)備。其結(jié)合液滴微流控技術(shù)和介電泳分選技術(shù)，由多光路熒光檢測(cè)系統(tǒng)、高速顯微成像系統(tǒng)、自動(dòng)對(duì)焦載物臺(tái)、微全分析系統(tǒng)、介電泳分選系統(tǒng)、圖像監(jiān)控系統(tǒng)和強(qiáng)大的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。可用于檢測(cè)、分選、挑取和分離單細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)、球體、類器等，為疾病檢測(cè)、個(gè)性化治療、疫苗研發(fā)、單克隆抗體制備以及生物制品制造等領(lǐng)域研究提供了準(zhǔn)確、高效、便捷、經(jīng)濟(jì)的自動(dòng)化工具。
近期，翌圣鎂孚泰基于天木生物高通量皮升級(jí)液滴單細(xì)胞分選系統(tǒng)（DREM cell）設(shè)備，在《The FEBS Journal》期刊上發(fā)表題為Engineered T7 RNA polymerase reduces dsRNA formation by lowering terminal transferase and RNA-dependent RNA polymerase activities的研究論文。該研究使用DREM cell高通量細(xì)胞分選儀，結(jié)合酶的定向進(jìn)化技術(shù)，對(duì)T7 RNAP進(jìn)行了成功改造，改造后的T7 RNAP在轉(zhuǎn)錄過程中能夠直接大幅減少dsRNA的生成（僅為野生型的1.8%），同時(shí)顯著提升了合成mRNA的整體效率和質(zhì)量。這一突破性進(jìn)展有望為基因治療和疫苗開發(fā)領(lǐng)域帶來革命性的變化，推動(dòng)相關(guān)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。
研究背景
雙鏈RNA（dsRNA）是體外轉(zhuǎn)錄（IVT）過程中常見的副產(chǎn)物，可激活宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)（如通過PKR和OAS通路抑制翻譯），影響mRNA藥物的安全性和有效性。T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）是IVT的核心工具，但其末端轉(zhuǎn)移酶活性和RNA依賴性RNA聚合酶（RDRP）活性會(huì)導(dǎo)致dsRNA生成。傳統(tǒng)方法依賴純化去除dsRNA，但本研究提出通過改造T7 RNAP本身減少dsRNA的產(chǎn)生，以提高mRNA產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性。
方法與技術(shù)平臺(tái)
1、高通量篩選技術(shù)（FADS）
原理：基于DREM cell設(shè)備液滴微流控方法生成液滴，液滴內(nèi)包含裂解試劑、熒光底物和過表達(dá)目標(biāo)酶突變體的大腸桿菌細(xì)胞，孵育過程進(jìn)行細(xì)胞的裂解和RNA轉(zhuǎn)錄，隨后將液滴導(dǎo)入分選芯片進(jìn)行熒光檢測(cè)和分選。
優(yōu)勢(shì)：超高通量（每日篩選106-108液滴）、低試劑消耗（皮升級(jí)反應(yīng)體積）。
流程：構(gòu)建隨機(jī)突變庫→液滴內(nèi)轉(zhuǎn)錄→熒光檢測(cè)→分選高熒光液滴（對(duì)應(yīng)低dsRNA突變體）
（液滴生成與分選）
2、分子信標(biāo)與雙探針檢測(cè)
分子信標(biāo)：結(jié)合RNA 3'端，熒光強(qiáng)度與互補(bǔ)區(qū)長(zhǎng)度正相關(guān)，用于區(qū)分完整RNA和dsRNA。
雙探針系統(tǒng)：5'端Cy5探針檢測(cè)RNA產(chǎn)量，3'端FAM探針檢測(cè)dsRNA含量，通過熒光比值篩選高產(chǎn)低副產(chǎn)物突變體。
3、半理性設(shè)計(jì)與結(jié)構(gòu)分析
靶點(diǎn)選擇：結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬（GROMACS）和FoldX/PROSS軟件，針對(duì)T7 RNAP構(gòu)象轉(zhuǎn)換關(guān)鍵區(qū)域（如螺旋C、H亞結(jié)構(gòu)域）進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變。
關(guān)鍵突變位點(diǎn)：A70Q（穩(wěn)定延伸構(gòu)象）、F162S/A247T（降低RDRP活性）、K180E（減少模板結(jié)合偏向性）。
4、功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
dsRNA檢測(cè)：J2抗體免疫印跡、ELISA定量。
免疫原性評(píng)估：轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞檢測(cè)IFN-β表達(dá)，HEK293細(xì)胞評(píng)估EGFP翻譯效率。
酶活性分析：通過發(fā)夾結(jié)構(gòu)底物檢測(cè)RDRP活性，NGS分析RNA 3'端異質(zhì)性評(píng)估末端轉(zhuǎn)移酶活性。
1. 突變體篩選與性能
使用DREM cell生成兩個(gè)百萬級(jí)液滴文庫（Lib3，Lib5），經(jīng)過兩輪分選成功篩選出關(guān)鍵候選突變體
單點(diǎn)突變體：M1（V214A）、M7（F162S/A247T）、M11（K180E）、M14（A70Q）顯著降低dsRNA生成（達(dá)野生型的3-7%）。
組合突變體：M17（A70Q/F162S/K180E），表現(xiàn)最優(yōu)，dsRNA含量?jī)H為野生型的1.8%，在篩選體系中僅為0.007 ng/μg。
這一結(jié)果不僅在體外實(shí)驗(yàn)中得到了驗(yàn)證，還在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出顯著的免疫原性降低和蛋白翻譯效率提升。我們將突變體轉(zhuǎn)錄的mRNA導(dǎo)入RAW264.7細(xì)胞后，最優(yōu)突變體M11產(chǎn)物引發(fā)的干擾素β（IFN-β）的mRNA和蛋白表達(dá)量?jī)H為野生型的9.7%和12.93 pg/mL。在HEK293細(xì)胞中，突變體mRNA的EGFP表達(dá)細(xì)胞數(shù)顯著增加，且熒光強(qiáng)度穩(wěn)定。這表明，減少dsRNA可有效解除PKR介導(dǎo)的翻譯抑制，釋放mRNA治療潛力。
2. 機(jī)制解析
末端轉(zhuǎn)移酶活性：野生型T7 RNAP傾向于在RNA 3'端添加額外核苷酸（如胞嘧啶），促進(jìn)互補(bǔ)配對(duì)；突變體（如M17）該活性降低50%以上。
RDRP活性：突變體對(duì)RNA模板的結(jié)合能力減弱，減少了以RNA為模板的互補(bǔ)鏈合成。
構(gòu)象穩(wěn)定性：突變（如A70Q）通過穩(wěn)定延伸構(gòu)象，減少流產(chǎn)RNA生成，從而間接抑制dsRNA形成。
為了深入了解突變體降低dsRNA的作用機(jī)制，我們通過計(jì)算機(jī)模擬與功能實(shí)驗(yàn)，揭示了突變體是由于降低了RNA依賴的RNA聚合酶（RDRP）活性和末端轉(zhuǎn)移酶活性而導(dǎo)致dsRNA的降低，這一發(fā)現(xiàn)為未來進(jìn)一步優(yōu)化 T7 RNAP提供了重要的理論依據(jù)。
3. 應(yīng)用潛力
突變體mRNA的免疫原性顯著降低（IFN-β表達(dá)下降90%），且翻譯效率提高（EGFP陽性細(xì)胞數(shù)增加）。
為mRNA疫苗/藥物的生產(chǎn)提供了更安全、高效的T7 RNAP工具。
1. 隨機(jī)突變庫+DREM cell：構(gòu)建基于分子信標(biāo)熒光探針的高通量分選系統(tǒng)，采用DREM cell累計(jì)篩選超過107個(gè)液滴，篩選效率大幅提升。
2. 微液滴反應(yīng)體系：液滴內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞裂解、轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及熒光探針結(jié)合過程，精準(zhǔn)捕捉低產(chǎn)dsRNA突變體，試劑消耗降低百倍。
3. 酶工程突破：T7 RNAP組合突變M17（A70Q/F162S/K180E），dsRNA含量降至野生型的1.8%。
4. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：M17突變體顯著降低免疫因子IFN-β表達(dá)，提升EGFP蛋白翻譯效率。
5. 機(jī)制揭秘：末端轉(zhuǎn)移酶活性是“元兇”，突變體通過降低末端轉(zhuǎn)移酶和RNA依賴的RNA聚合酶（RDRP）活性，減少3'端非模板核苷酸添加，阻斷dsRNA互補(bǔ)配對(duì)。
關(guān)于DREM cell 高通量液滴微流控細(xì)胞分選儀
DREM cell 是一款集合液滴生成、液滴分選、液滴微注入及液滴打印的多功能、高通量、全自動(dòng)設(shè)備。其結(jié)合液滴微流控技術(shù)和介電泳分選技術(shù)，由多光路熒光檢測(cè)系統(tǒng)、高速顯微成像系統(tǒng)、自動(dòng)對(duì)焦載物臺(tái)、微全分析系統(tǒng)、介電泳分選系統(tǒng)、圖像監(jiān)控系統(tǒng)和強(qiáng)大的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。可用于檢測(cè)、分選、挑取和分離單細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)、球體、類器等，為疾病檢測(cè)、個(gè)性化治療、疫苗研發(fā)、單克隆抗體制備以及生物制品制造等領(lǐng)域研究提供了準(zhǔn)確、高效、便捷、經(jīng)濟(jì)的自動(dòng)化工具。
