本期為您推薦天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院路福平教授、秦慧民教授團(tuán)隊(duì)在《Biosensors and Bioelectronics》發(fā)表重要研究成果：Programming a bacterial biosensor for directed evolution of tryptophan hydroxylase via high-throughput droplet sorting。
本研究基于細(xì)菌生物傳感器，結(jié)合高通量液滴分選平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了色氨酸羥化酶的定向進(jìn)化，成功獲得了催化活性比親本高4.25倍的M4-1（D129L/Q132M/P103A/T236K）突變體。
關(guān)于色氨酸羥化酶
5-羥色胺（5-HydroxyTryptamine，5-HT）是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，又名血清素（serotonin），是讓我們大腦感到“快樂”的激素，能抑制憂郁、促進(jìn)褪黑素合成、改善睡眠質(zhì)量等，對(duì)于睡眠與消化都起到至關(guān)重要的作用，在治療疾病等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。5-HT是色氨酸代謝過程中的中間體，由色氨酸羥化酶（TPH）催化產(chǎn)生。由于TPH天然酶活性不足、穩(wěn)定性差，限制了工業(yè)生產(chǎn)過程，更有效的TPH變體的開發(fā)便引起了科學(xué)和工業(yè)界的極大關(guān)注。
定向進(jìn)化方法與技術(shù)平臺(tái)
基于液滴微流控技術(shù)，作者構(gòu)建了色氨酸羥化酶超高通量微流控篩選平臺(tái)（DTSP），旨在改善TPH的應(yīng)用性能。作者設(shè)計(jì)了一種用于檢測(cè)L-色氨酸（L-Trp）的細(xì)菌生物傳感器，該傳感器將L-Trp濃度與熒光信號(hào)之間聯(lián)系起來，基于熒光信號(hào)檢測(cè)，結(jié)合迭代飽和誘變策略，成功獲得了熱穩(wěn)定性提高（45℃條件下的半衰期延長(zhǎng)3.2倍），催化活性提高（比親本高4.25倍）的M4-1（D129L/Q132M/P103A/T236K）突變體。
色氨酸羥化酶超高通量微流控篩選平臺(tái)（DTSP）
1. 色氨酸羥化酶超高通量微流控篩選平臺(tái)（DTSP）的設(shè)計(jì)與構(gòu)建
DTPS平臺(tái)的設(shè)計(jì)及構(gòu)建主要分為三個(gè)主要步驟（圖1）
① 構(gòu)建TPH突變文庫(kù)，然后使用液滴生成裝置將突變后的產(chǎn)酶菌（Enzyme-producing bacteria，EPB）包裹形成含單細(xì)胞的液滴，孵育一段時(shí)間后，EPB在液滴中進(jìn)行細(xì)胞增殖和L-Trp的生物轉(zhuǎn)化過程；
② 將基因改造后的檢測(cè)細(xì)菌（Detection bacteria，DB）預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間后，注射入液滴內(nèi)再次孵育；
③ 通過檢測(cè)液滴中剩余的L-Trp產(chǎn)生熒光信號(hào)來測(cè)定酶的工作效率，并分離陽(yáng)性突變體以進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。
圖1 色氨酸羥化酶超高通量微流控篩選平臺(tái)（DTSP）構(gòu)建流程
2. 液滴微流控平臺(tái)工作流程
DTSP平臺(tái)由三部分組成：液滴生成、液滴微注入和液滴分選。為了保證液滴的單細(xì)胞包裹率，根據(jù)泊松分布（μ=0.1）生成包裹單個(gè)細(xì)胞的液滴，37℃孵育12小時(shí)后，根據(jù)熒光信號(hào)分選獲得目標(biāo)液滴，在培養(yǎng)和分選過程中液滴形態(tài)完整，細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)良好。
控篩選平臺(tái)（DTSP），旨在改善TPH的應(yīng)用性能。作者設(shè)計(jì)了一種用于檢測(cè)L-色氨酸（L-Trp）的細(xì)菌生物傳感器，該傳感器將L-Trp濃度與熒光信號(hào)之間聯(lián)系起來，基于熒光信號(hào)檢測(cè)，結(jié)合迭代飽和誘變策略，成功獲得了熱穩(wěn)定性提高（45℃條件下的半衰期延長(zhǎng)3.2倍），催化活性提高（比親本高4.25倍）的M4-1（D129L/Q132M/P103A/T236K）突變體。
圖2 液滴微流控平臺(tái)工作流程
3. 基于DTSP的CviPAH突變文庫(kù)的篩選
使用epPCR構(gòu)建CviPAH突變文庫(kù)，經(jīng)過兩輪活性和熱穩(wěn)定性篩選后，得到了8個(gè)優(yōu)勢(shì)突變體，酶活性增加了30-113%，且均表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性，在45℃下熱處理1小時(shí)后剩余活性為39.5-53.7%，顯著好于野生型CviPAH。結(jié)合迭代飽和誘變（ISM）和液滴微流控平臺(tái)（DTSP）進(jìn)一步篩選獲得突變體M4-1（D129L/Q132M/P103A/T236K），其酶活性比野生型CviPAH增高了4.25倍，催化效率提高了13.9倍，熱穩(wěn)定性提高了3.2倍。
圖3 基于DTSP的CviPAH突變文庫(kù)的篩選
總結(jié)
細(xì)菌生物傳感器與基于液滴的微流控篩選平臺(tái)（DTSP）相結(jié)合，在篩選工業(yè)用酶等領(lǐng)域具有顯著優(yōu)勢(shì)。并且，使用兩個(gè)獨(dú)立菌株分別進(jìn)行酶生產(chǎn)和檢測(cè)，有助于提高篩選過程的準(zhǔn)確性和效率。該研究為酶類的篩選提供了一個(gè)強(qiáng)有力的工具，并為篩選工業(yè)酶建立了一個(gè)高效的方案。
天木生物孵化于清華大學(xué)無錫應(yīng)用技術(shù)研究院，深耕于液滴微流控領(lǐng)域多年，具有成熟的研發(fā)團(tuán)隊(duì)，將液滴微流控技術(shù)與微管式反應(yīng)器技術(shù)完美結(jié)合，其自主研發(fā)單細(xì)胞高通量分選設(shè)備（DREM cell及MISS cell），全自動(dòng)化完成液滴生成、液滴培養(yǎng)和液滴檢測(cè)及篩選的全工作流程，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥研發(fā)、酶的篩選及進(jìn)化、合成生物學(xué)等多領(lǐng)域。設(shè)備自動(dòng)化程度高，操作簡(jiǎn)單，大幅提高篩選效率，為醫(yī)藥、工業(yè)及科學(xué)研發(fā)提供強(qiáng)有力的高精尖設(shè)備和技術(shù)支持。
本期為您推薦天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院路福平教授、秦慧民教授團(tuán)隊(duì)在《Biosensors and Bioelectronics》發(fā)表重要研究成果：Programming a bacterial biosensor for directed evolution of tryptophan hydroxylase via high-throughput droplet sorting。
本研究基于細(xì)菌生物傳感器，結(jié)合高通量液滴分選平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了色氨酸羥化酶的定向進(jìn)化，成功獲得了催化活性比親本高4.25倍的M4-1（D129L/Q132M/P103A/T236K）突變體。
關(guān)于色氨酸羥化酶
5-羥色胺（5-HydroxyTryptamine，5-HT）是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，又名血清素（serotonin），是讓我們大腦感到“快樂”的激素，能抑制憂郁、促進(jìn)褪黑素合成、改善睡眠質(zhì)量等，對(duì)于睡眠與消化都起到至關(guān)重要的作用，在治療疾病等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。5-HT是色氨酸代謝過程中的中間體，由色氨酸羥化酶（TPH）催化產(chǎn)生。由于TPH天然酶活性不足、穩(wěn)定性差，限制了工業(yè)生產(chǎn)過程，更有效的TPH變體的開發(fā)便引起了科學(xué)和工業(yè)界的極大關(guān)注。
定向進(jìn)化方法與技術(shù)平臺(tái)
基于液滴微流控技術(shù)，作者構(gòu)建了色氨酸羥化酶超高通量微流控篩選平臺(tái)（DTSP），旨在改善TPH的應(yīng)用性能。作者設(shè)計(jì)了一種用于檢測(cè)L-色氨酸（L-Trp）的細(xì)菌生物傳感器，該傳感器將L-Trp濃度與熒光信號(hào)之間聯(lián)系起來，基于熒光信號(hào)檢測(cè)，結(jié)合迭代飽和誘變策略，成功獲得了熱穩(wěn)定性提高（45℃條件下的半衰期延長(zhǎng)3.2倍），催化活性提高（比親本高4.25倍）的M4-1（D129L/Q132M/P103A/T236K）突變體。
色氨酸羥化酶超高通量微流控篩選平臺(tái)（DTSP）
1. 色氨酸羥化酶超高通量微流控篩選平臺(tái)（DTSP）的設(shè)計(jì)與構(gòu)建
DTPS平臺(tái)的設(shè)計(jì)及構(gòu)建主要分為三個(gè)主要步驟（圖1）
① 構(gòu)建TPH突變文庫(kù)，然后使用液滴生成裝置將突變后的產(chǎn)酶菌（Enzyme-producing bacteria，EPB）包裹形成含單細(xì)胞的液滴，孵育一段時(shí)間后，EPB在液滴中進(jìn)行細(xì)胞增殖和L-Trp的生物轉(zhuǎn)化過程；
② 將基因改造后的檢測(cè)細(xì)菌（Detection bacteria，DB）預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間后，注射入液滴內(nèi)再次孵育；
③ 通過檢測(cè)液滴中剩余的L-Trp產(chǎn)生熒光信號(hào)來測(cè)定酶的工作效率，并分離陽(yáng)性突變體以進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。
圖1 色氨酸羥化酶超高通量微流控篩選平臺(tái)（DTSP）構(gòu)建流程
2. 液滴微流控平臺(tái)工作流程
DTSP平臺(tái)由三部分組成：液滴生成、液滴微注入和液滴分選。為了保證液滴的單細(xì)胞包裹率，根據(jù)泊松分布（μ=0.1）生成包裹單個(gè)細(xì)胞的液滴，37℃孵育12小時(shí)后，根據(jù)熒光信號(hào)分選獲得目標(biāo)液滴，在培養(yǎng)和分選過程中液滴形態(tài)完整，細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)良好。
控篩選平臺(tái)（DTSP），旨在改善TPH的應(yīng)用性能。作者設(shè)計(jì)了一種用于檢測(cè)L-色氨酸（L-Trp）的細(xì)菌生物傳感器，該傳感器將L-Trp濃度與熒光信號(hào)之間聯(lián)系起來，基于熒光信號(hào)檢測(cè)，結(jié)合迭代飽和誘變策略，成功獲得了熱穩(wěn)定性提高（45℃條件下的半衰期延長(zhǎng)3.2倍），催化活性提高（比親本高4.25倍）的M4-1（D129L/Q132M/P103A/T236K）突變體。
圖2 液滴微流控平臺(tái)工作流程
3. 基于DTSP的CviPAH突變文庫(kù)的篩選
使用epPCR構(gòu)建CviPAH突變文庫(kù)，經(jīng)過兩輪活性和熱穩(wěn)定性篩選后，得到了8個(gè)優(yōu)勢(shì)突變體，酶活性增加了30-113%，且均表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性，在45℃下熱處理1小時(shí)后剩余活性為39.5-53.7%，顯著好于野生型CviPAH。結(jié)合迭代飽和誘變（ISM）和液滴微流控平臺(tái)（DTSP）進(jìn)一步篩選獲得突變體M4-1（D129L/Q132M/P103A/T236K），其酶活性比野生型CviPAH增高了4.25倍，催化效率提高了13.9倍，熱穩(wěn)定性提高了3.2倍。
圖3 基于DTSP的CviPAH突變文庫(kù)的篩選
總結(jié)
細(xì)菌生物傳感器與基于液滴的微流控篩選平臺(tái)（DTSP）相結(jié)合，在篩選工業(yè)用酶等領(lǐng)域具有顯著優(yōu)勢(shì)。并且，使用兩個(gè)獨(dú)立菌株分別進(jìn)行酶生產(chǎn)和檢測(cè)，有助于提高篩選過程的準(zhǔn)確性和效率。該研究為酶類的篩選提供了一個(gè)強(qiáng)有力的工具，并為篩選工業(yè)酶建立了一個(gè)高效的方案。
天木生物孵化于清華大學(xué)無錫應(yīng)用技術(shù)研究院，深耕于液滴微流控領(lǐng)域多年，具有成熟的研發(fā)團(tuán)隊(duì)，將液滴微流控技術(shù)與微管式反應(yīng)器技術(shù)完美結(jié)合，其自主研發(fā)單細(xì)胞高通量分選設(shè)備（DREM cell及MISS cell），全自動(dòng)化完成液滴生成、液滴培養(yǎng)和液滴檢測(cè)及篩選的全工作流程，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥研發(fā)、酶的篩選及進(jìn)化、合成生物學(xué)等多領(lǐng)域。設(shè)備自動(dòng)化程度高，操作簡(jiǎn)單，大幅提高篩選效率，為醫(yī)藥、工業(yè)及科學(xué)研發(fā)提供強(qiáng)有力的高精尖設(shè)備和技術(shù)支持。
